Для ветеринарных врачей

Главная страница
Литература для ветеринаров
Демодекоз у собак
Антибиотики, сульфаниламиды и нитрофураны в ветеринарии
Анестезиология и реаниматология собак и кошек
Иммунодефициты домашних животных
  • Введение
  • Иммунная система - основные понятия
  • Первичные иммунодефициты
  • Вторичные (приобретенные) иммунодефициты
  • Механизмы вирус-индуцированной иммуносупрессии
  • Методы клинико-иммунологической диагностики
  • Стратегия иммунокоррекции
  • Заключение
  • Инфекционные болезни собак и кошек
    Грибковые болезни животных
    Незаразные болезни собак и кошек
    Офтальмология
    Радиография сердечно-сосудистой системы
    Торакальное УЗИ мелких животных
    Лабораторные исследования

     

     

    Методы клинико-иммунологической диагностики

    Иммунологические методы, используемые в экспериментальных исследованиях и клинической практике, достаточно разнообразны. С их помощью можно определять иммунный статус животных в норме и при патологии, осуществлять контроль за восстановлением иммунологической компетентности организма в процессе лечения методами иммунотерапии. Для определения первичного или вторичного иммунодефицита необходимо использовать лабораторные методы, которые позволяют определить количество и функциональную активность Т-, В-клеток и нейтрофилов. Кроме того, проводится количественное определение компонентов комплемента в сыворотке крови для установления их роли в иммунной дисфункции. При этом, выбор методов и рекомендаций по их практическому применению представляет определенную проблему, поскольку многие из них не являются рутинными в ветеринарной клинической практике и используются только в научно-исследовательских лабораториях или находятся на стадии разработок. Тем не менее, некоторые методы могут служить важным инструментом распознавания и понимания иммунодефицитов животных (Табл.5, 6).

    Сокращения в таблице 6: РИД - радиальная иммунодиффузия; РГЗТ - реакция гиперчувствительности замедленного типа; ФГА - фитогемагглютинин; ЕАС-розетки -метод комплементарного розеткообразования; ИФМ -метод иммунофлюоресцентной микроскопии; РБТЛ -реакция бласттрансформации лимфоцитов; МГБ - метод гемолитических бляшек; ТБТ - турбидиметрический тест; РЛА - реакция латекс-агглютинации; ИФА - иммуноферментный метод.

    Табл.5. Некоторые лабораторные тесты, используемые для диагностики иммунодефицитов животных

    Тип клеток

    Количественные методы определения

    Методы определения функциональной активности

    Т

    Лейкограмма

    Метод спонтанного розеткообразования

    • Реакция гиперчувствительности замедленного типа (in vivo)
    • Реакция бласттрансформации
    • Реакция отторжения трансплантата (экспериментальная)

    В

    • Метод иммунофлюоресценции
    • Метод комплементарного розеткообразования
    • Метод гемолитических бляшек
    • Радиальная иммунодиффузия
    • Ракетный иммуноэлектрофорез
    • Иммуноферментный анализ
    • Радиоиммунный анализ
    • Реакция бласттрансформации (с митогеном лаконоса)

    Иммунизация (иммунный ответ in vivo на введение вакцин)

    Нейтрофилы

    Лейкограмма

    Световая микроскопия

    Электронная микроскопия

    • Метод исследования миграции лейкоцитов с использованием камеры Бойдена
    • Определение фагоцитарного индекса
    • Определение бактерицидной активности
    • Реакция восстановления нитросинего тетразолия
    • Хемилюминесценция

    Комплемент

    Радиальная иммунодиффузия

    Определение гемолитической активности комплемента (СН50)

     

    Табл.6. Иммунологические тесты, используемые для диагностики некоторых иммунодефицитов животных

    Иммуно-дефициты

    Методы определения, используемые в практике

    Другие возможные методы определения

    Комбинированный иммунодефицит арабских жеребят

    РИД (отсутствие IgM)

    Лейкограмма (лимфопения) РГЗТ (с ФГА) Гистология(тимус, селезенка, лимфоузлы)

    ЕАС-розетки ИФМ РБТЛ МГБ ТБТ (с ZnS04) ИФА

    Нарушение пассивной передачи антител

    ТБТ РЛА

    РИД ИФА

    Агаммаглобулинемия

    РИД или ТБТ Гистология (селезенка, лимфоузлы)

    ЕАС-розетки ИФА ИФМ МГБ

    Селективные дефициты иммуноглобулинов

    РИД

    ИФА МГБ ИФМ

    Гипоплазия тимуса (черно-пестрый 1 датский скот, бультерьеры и др.)

    Метод спонтанного розеткообразования РГЗТ Гистология (тимус, селезенка, лимфоузлы) Лейкограмма (лимфопения)

    РБТЛ

    Гранулоцитопатия собак

    Определение бактерицидной активности Реакция восстановления нитросинего тетразолия Исследование мазков крови (нейтрофилия, гиперсегментированные нейтрофилы)

    Метод определения миграции лейкоцитов \ Определение фагоцитарного индекса

    Синдром Чедиак-Хигаши

    Исследование мазков крови (аномальные гранулы)

    Определение фагоци- > тарного индекса и бактерицидной активности

    Циклический гематопоэз Колли

    Лейкограмма

     

    СЗ дефицит у Британских спаниелей

    РИД

    Определе- \ ние гемоли-тической активности комплемента

     

    5.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Т-КЛЕТОЧНЫХ ДЕФИЦИТОВ

    Для определения количества или функциональной активности Т-клеток обычно используется следующие лабораторные тесты:

    • дифференциальный подсчет количества лейкоцитов (лейкограмма);
    • реакция гиперчувствительности замедленного типа (кожный тест);
    • спонтанное розеткообразование лимфоцитов с эритроцитами барана;
    • реакция бласттрансформации лимфоцитов.

    Лимфопения, обнаруженная с помощью обычной лейкограммы, часто отражает уменьшение числа Т-клеток, поскольку у большинства видов животных Т-клетки составляют около 75% лимфоцитов крови. Поэтому, уменьшение общего количества лимфоцитов обычно связано с уменьшением Т-клеток.

    Реакция гиперчувствительности замедленного типа, определяемая с помощью кожного теста, используется у некоторых видов животных для оценки функциональной активности Т-клеток. Например, когда жеребятам с комбинированным иммунодефицитом вводят внутрикожно фитогемагглютинин, то у них не развивается положительная реакция. У собак наблюдается слабая реакция гиперчувствительности замедленного типа на введение большинства антигенов и митогенов, поэтому использование этого метода для оценки Т-клеточного дефицита у этого вида требует осторожной интерпретации результатов.

    У человека 100% циркулирующих Т-клеток спонтанно образуют розетки с эритроцитами барана, поэтому этот метод является простым и достоверным методом определения Т-клеток. У животных этот метод менее достоверен, поскольку не все Т-клетки формируют розетки с эритроцитами барана (у собак только 50%).

    Способность лимфоцитов in vitro отвечать на некоторые митогены клеточным делением и пролиферацией лежит в основе реакции бласттрансформации, используемой для оценки функций Т-клеток. В этом методе наиболее часто используются такие митогены как конкавалин А и фитогемагглютинин. Использование В-клеточного митогена позволяет оценивать функцию В-клеток. Различные виды животных отличаются по чувствительности к митогенам, поэтому необходим тщательный выбор митогена и схемы его применения.

    5.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ В-КЛЕТОЧНЫХ ДЕФИЦИТОВ

    Для определения количества функционально активных В-клеток в крови используются:

    • метод иммунофлюоресценции основан на выявлении молекул иммуноглобулина, находящихся на поверхности В-клеток с использованием конъюгированных антител к IgG, IgA, IgM соответствующего вида животных;
    • метод комплементарного розеткообразования (ЕАС) основан на образовании розеток с эритроцитами барана, сенсибилизированных антителами к эритроцитам барана и комплементом. Метод недостаточно стандартизирован для рутинного использования в ветеринарии;
    • метод гемолитических бляшек используется для идентификации антитело-продуцирующих В-лимфоцитов и включает химическое связывание антигена с эритроцитами барана, использование плат с кровяным агаром, куда добавляется суспензия лимфоцитов. Иммуноглобулины, секретируемые В-клетками, связываются с эритроцитами, покрытыми антигеном. При добавлении раствора, содержащего комплемент, происходит лизис сенсибилизированных эритроцитов с образованием зоны гемолиза вокруг каждой функционально активной В-клетки. Число В-клеток определяется подсчетом количества гемолитических бляшек. Вариации этого теста (прямой, непрямой, обратный) используются для идентификации таких состояний как селективная субкласс-специфическая агаммаглобулинемия (например, селективный IgA-дефицит). В этом случае используется обратный вариант метода, который включает в себя взаимодействие эритроцитов барана с анти-IgA-антителами;
    • метод радиальной иммунодиффузии (РИД) для количественного определения уровня иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA) в сыворотке крови, по результатам которого можно судить о функциональных свойствах В-клеток. При постановке РИД моноспецифическую антисыворотку (или моноклональные антитела, обладающие преципитирующей активностью) к отдельным классам иммуноглобулинов диспергируют в агаровый гель, смесь наносят на стекло и в застывшем агаре вырезают лунки, в которые вносят испытуемые сыворотки. Антиген (IgG, IgM, IgA) диффундирует в гель, и, взаимодействуя с антителами, образует вокруг лунки кольцо преципитации, диаметр которого прямо пропорционален концентрации иммуноглобулина в испытуемой пробе. Наряду с исследуемым материалом в другие лунки вносят раствор антигена уже известной концентрации (стандартная сыворотка). Диаметр кольца преципитации, измеренный через 24- 48 часов, сравнивают со стандартом. Количество Ig определяется по измерению диаметра кольца преципитации относительно калибровочной кривой, которая строится с использованием стандартной сыворотки. Метод обладает высокой чувствительностью и воспроизводимостью, кроме того он прост и доступен;
    • метод ракетного иммуноэлектрофореза (или электроиммунодиффузии), является модификацией РИД и может также широко применяться для количественного определения 1д в исследуемых сыворотках. Метод основан на соединении техники электрофореза и основных принципов РИД (феномен преципитации, определение концентрации антигена по стандартной кривой). При этой модификации антиген, внесенный в лунки агара, смешанного с антителами, подвергают электрофоретическому разделению до формирования пика преципитата в форме ракеты. Высота полосы преципитации пропорциональна концентрации антигена. Метод более чувствителен и менее продолжителен, чем РИД.

    Кроме вышеперечисленных методов, для определения В-клеточных иммунодефицитов также используются турбидиметрический тест (основан на измерении оптической плотности смеси сыворотка - Na2SO4 для крупного рогатого скота, сыворотка - (NH4) 2SO4 для свиней, сыворотка - ZnSO4 для лошадей), реакция бласттрансформации лимфоцитов, реакция латекс-агглютинации, а также иммуноферментный (ИФА) и радиоиммунный (РИА) методы.

    5.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЕФИЦИТОВ НЕЙТРОФИЛОВ

    Наиболее распространенным методом количественного определения и характеристики морфологических дефектов нейтрофилов является лейкограмма и цитологические исследования с использованием световой и электронной микроскопии.

    Для определения хемотаксической активности нейтрофилов применяют метод исследования миграции лейкоцитов с использованием камеры Бойдена. Метод основан на разделении микропористым фильтром в растворе двух реагирующих компонентов: нейтрофилов и хемотаксических агентов (например C5a-des Arg.), которые помещаются в нижнюю камеру и создают концентрационный градиент. Помещенные в верхнюю камеру нейтрофилы мигрируют вдоль градиента и собираются на нижней поверхности фильтра. После стандартной инкубации фильтры извлекают, окрашивают и подсчитывают количество клеток. Метод довольно прост и отличается весьма высокой воспроизводимостью. Этот же принцип лежит в основе метода клеточной миграции под агарозным гелем, который используется для определения хемотаксического индекса.

    Фагоцитарный индекс нейтрофилов определяется путем подсчета количества поглощенных бактерий одной клеткой после инкубации клеток пациента со стандартными препаратами St.aureus или E.coli и окраски полученных мазков. Модификацией этого теста является метод определения бактерицидной активности, при котором отмытая суспензия клеток инкубируется с бактериальной суспензией, затем смесь наносится на поверхность кровяного агара и через определенное время подсчитывается количество выросших бактериальных колоний. Оба метода требуют стандартизации для использования в каждой конкретной лаборатории и сведений об антибиотиковой терапии, которая может быть причиной недостоверных результатов или ошибок в их интерпретации.

    Для определения фагоцитарной метаболической (кислородо-зависимой) активности нейтрофилов используется реакция восстановления нитросинего тетразолия (НСТ). Тест включает в себя инкубацию нейтрофилов с НСТ in vitro, и по формированию нерастворимых окрашенных зерен формазана можно судить о восстановлении НСТ супероксидным радикалом, образующимся при активации фагоцитов. Отсутствие осадка свидетельствует о неспособности клеточной популяции фагоцитов к метаболизму. Очень важным при получении проб клеток крови пациентов является отсутствие гепарина в антикоагулянте, так как высокая концентрация гепарина может негативно влиять на результаты этого теста.

    Другим методом оценки "респираторного взрыва" в фагоцитах является измерение спонтанной и индуцированной хемилюминесценции. Феномен респираторного (или метаболического) взрыва связан со значительным увеличением кислорода, поглощаемого лейкоцитами при фагоцитозе, в результате чего происходит образование супероксидного радикала (Оз-) и перекиси водорода. Все эти соединения обладают микробоцидными свойствами, и их идентификация представляет собой важный этап в оценке функциональной активности фагоцитарных клеток.

    5.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЕФИЦИТА КОМПЛЕМЕНТА

    Количественное определение компонентов системы комплемента (главным образом СЗ) проводят с использованием специфических антисывороток методом радиальной иммунодиффузии. Уменьшение количества СЗ в крови отмечается при лимфоцитарном тиреоидите и гломерулонефрите, связанным с образованием иммунных комплексов у собак. При ревматоидном артрите наблюдается значительное снижение концентрации комплемента в суставной жидкости собак. В будущем рутинное использование РИД для определения уровня СЗ у животных несомненно будет полезным для диагностики иммунодефицитов и других болезней, связанных с иммунной системой. Для определения уровня комплемента в крови используется метод определения гемолитической активности комплемента. Принцип метода заключается в том, что иммунные комплексы активируют систему комплемента с образованием мембраноатакующего компонента. Исследуемую сыворотку крови инкубируют с эритроцитами барана, нагруженными антителами, в результате чего происходит лизис эритроцитов за счет присутствия комплемента в испытуемой пробе. Активность комплемента выражают в условных гемолитических единицах (CH50). За CH50 принимают последнее разведение сыворотки, которое вызывает 50% гемолиз стандартного числа сенсибилизированных эритроцитов. Этот метод может быть использован для определения всех компонентов системы комплемента.

    5.5. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ НАРУШЕНИЙ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ

    В практику медицинских лабораторно-диагностических подразделений постепенно внедряются новые и более совершенные методы обследования больных с различной иммунопатологией. В настоящее время для проведения массовых иммунологических обследований в медицине внедрена система микротестов с использованием монокло-нальных антител. Моноклональные антитела широко используются для определения субпопуляций Т-лимфоцитов с помощью иммунофлуоресцентного микроскопирования и проточной цитометрии. Существуют также коммерческие наборы для выявления и количественного определения хелперных и супрессорных субпопуляций Т-лимфоцитов, а также Т- и В-лимфоцитов, состоящие из синтетических пластиковых микросфер или микробусинок, к поверхности которых присоединены специфические антитела. Внедрение аналогичных методов в практику ветеринарной клинической иммунологии на сегодняшний день представляет проблему, хотя их использование открывает новые перспективы для диагностики иммунодефицитов животных.

    Все высокочувствительные методы требуют наличия вы-сокоспецифичных моноклональных антител к маркерам различных субпопуляции лимфоцитов и других клеток иммунной системы, которые в соответствии с международной классификацией сведены в группе! и обозначены, как кластеры дифференцировки или CD. Каждой группе CD присвоен порядковый номер, общий для человека и животных, и соответствующие наборы антител позволяют выявлять клетки иммунной системы, несущие конкретные антигены. В ветеринарии работ в этом направлении значительно меньше, хотя такие фирмы как "Serotec" (Англия), VMRD, Inc. (США) уже предлагают для научных целей ряд моноклональных антител к маркерам лейкоцитов, молекулам МНС и иммуноглобулинам различных видов животных. Интенсивные научные разработки в этом направлении ведутся в лабораториях ряда университетов и в научно- исследовательских центрах США и Европы.

    Помимо этого, очень перспективными для ветеринарной иммунологии следует признать такие методы, как ELISPOT и "сэндвич"-ИФА, которые в настоящее время используются только в научно-исследовательских лабораториях и пока не нашли широкого применения в качестве рутинных тестов. В частности, метод ELISPOT может использоваться для количественного подсчета В-лимфоцитов, секретирующих иммуноглобулины каждого класса (G, М, А), а "сэндвич" - ИФА может применяться для количественного определения уровня Ig. Эти методы также требуют наличия моноклональных антител и являются одними из самых чувствительных и специфичных.

    В заключение этого раздела необходимо отметить, что существующие на сегодняшний день методы оценки иммунного статуса в норме и патологии практически не внедрены в ветеринарную практику, что не позволяет совершенствовать уровень иммунологических исследований и разрабатывать новые подходы диагностики иммунодефицитных состояний животных.

      Для ветеринарных врачей - http://vetvrach.info